真空采血器的技术特点及应用
作者：焦连亭、耿洁 单位：天津中医学院第一附属医院
http://www.51yixun.com 来源：中华检验医学杂志
1997 年朱忠勇教授在临床检验信息导报上撰文谈推广真空采血技术势在必行,4 年过去了,我国真空采血技术的应用有了很大的发展。与传统的采血技术相比,其有许多独特的技术,优点也是显而易见的。如果我们对这些技术和特点有一个明确的了解,则会很好的加以利用,达到提高检验质量的目的,反之,其技术优势不但得不到发挥还会得到相反的结果。因此有必要对真空采血技术的特点及应用作一介绍,拟从真空采血技术的材料学、添加剂及使用中应注意的问题三个方面作一介绍。
一、材料的性能指标
自动化仪器的大量使用及血液的保存对血样原始性状稳定性提出了更高的要求,使真空采血技术突破了仅仅只为安全的要求,而准确性、标本的原始性状、维持时间及管机配合、试管强度等性能指标都不能忽视,影响标本原始性状及检测准确性的因素有如下几项。
1. 空采血管的材质:现在采血管多为玻璃材料,普通玻璃的pH相差甚远,溶血的可能性大大增加,而拉管工艺制作的玻璃试管线性沟密布,深浅粗细无常导致细胞的挂壁,因此使用中性玻璃(药用玻璃) 是一个大的趋势。中性玻璃具有耐压,溶出物少,分子排列紧密,拉伸时沟槽少等优点,但仍有表面负电荷过强,pb2+、Zn2+、K+、Fe2+的相对溶出等缺点。这些都可能改变血液标本的原始性状,因此玻璃试管在使用前应进行无菌和内壁处理。传统的内壁处理就是硅化,即将硅油分散在乙醚与乙醇中,涂覆管壁晾干或烘烤即成。由于硅油是一种惰性极强的混合物,不可能与玻璃表面发生任何性质的化学作用,只是粘附在试管内壁,牢度较低。另外硅油对预先加入的抗凝剂的有机酸根具有包覆作用,使试剂的络合能力丧失,造成凝血。BD 公司的处理方法为钴60照射,去离子水冲洗,确保无菌、光滑、无异物,有效防止溶血。对无添加剂的采血管内壁涂有硅酮,避免血细胞附壁,防止离心时细胞破碎。好的玻璃管材可耐受3 次以上2 米高度自由落体运动,有效防止采集、运输、试验过程中标本泄漏。亦可使用塑料材料,质轻便于运输,破损率小,用后可直接高压灭菌或焚烧销毁。
2. 密封胶塞:密封胶塞的质量直接影响到试管的真空性能及血液样本的原始状态,推荐使用丁基橡胶而不用天然橡胶。天然橡胶填料外渗严重,是一种可致溶血的材料,许多有机填料和助剂(包括石蜡油,硅油,柔软剂,着色剂等) 在真空状态下会沿玻璃管壁往下爬,这类物质尤其影响真空干燥的肝素类物质的水溶性而导致凝血。另外其气透性及水透性也不符合真空管的技术要求,真空丢失严重,管塞结合部可见塞屑粘壁严重。而丁基橡胶具有良好的塞封性能,溶出物大大减少,使得采血管即便是在101.3 kPa 的负压时仍能在24 个月内保持真空恒定。真空恒定使采血对象即使有血压及血液粘度的差别,以及采血环境温度的变化仍能保持采血量的相对准确,实际采血量误差可控制在±5%以内。误差的来源主要是血液粘度的变化和操作偶然误差,另一方面则是试管口径的细微差别。
现代采血管多采用双层管帽设计,在内层涂有润滑剂的橡胶软塞外面套有纹面塑料管盖,使开启极为轻松,其侧滑式的开启方式可防止血液的飞溅。胶塞脊形的设计,使盖更加牢固,盖子顶部凹下部分可保证防止接触血液标本,减少对操作人员的血源污染。采用国际通用的头盖颜色标记采血管用途,鲜明夺目,极易分辨,避免采血时用错添加剂以及送检样本与检测项目不符。
3. 双向采血针:即静脉穿刺针和管塞针,中间软和硬连接,形成采血系统,一次进针,多管采血。针头切割边缘,长度及角度采用电脑设计,专门应用于静脉穿刺,切割边缘极为平滑,新型硅胶外膜,使患者的不适及采样后遗留的疼痛大大减轻。针管内表面极度光滑,管壁最薄,采血速度快,细胞破损少。
管塞针的止血护套在脱离胶塞时能永久封住针头,护套回弹毋需时间积累,效率极高。护套防止疲劳时限应超过24 个月,该时限内连续冲击30 次,回弹复位率应达100%。
持针器的设计多为静脉穿刺和管塞穿刺针双向直通式,采样时只需换双向针头,可反复使用。最近推出的pronto 持针器。采用卡环设计,采样后只需轻按绿色卡环,即可卸下双向采血针,快速简便,与其配套的设计还有废针丢弃盒,避免采血者被污染针头所伤[1]。北京创格公司的上插式(直角式) 持针器,回血清晰,采血量易观察不易穿透静脉。奥地利greiner 的偏心嘴管的持针架Holdex 刺入静脉角度好,使用方便。
4. 试管的直径:国标试管的直径是11. 6～12. 0 mm ,而现代医学检验中的自动生化分析仪以及血液分析仪,大多为美国、日本产品,其样品架内卡直径为13 mm ,国标管显然过小。直接上机后无法固定而程度不同的倾斜,偏离探针运作时的轴心,探针被击伤的可能性大大增加。而真空采血管多采用13 (16)mm ⅹ75 mm、13 (16)mm ⅹ100 mm 的规格,适用于日立、贝克曼2库尔特、东芝、奥林巴斯、岛津、雅培、拜尔、罗氏、Dade2Bering、法玛西亚等仪器直接上机使用。
除上述真空采血系统的技术特点外,新的产品亦不断涌现,如血液微量采集系统、尿液采集系统、血沉采集测量一体化系统、类注射器一次采集系统等,使标本的采集更加方便、规范、准确。
二、添加剂的正确使用
添加剂包括多种成分,如抗凝剂、促凝剂、缓冲剂、保护剂、分离胶等。其品种、性能、浓度直接影响血样的性状和检测结果。真空采血技术则在品种、浓度方面做到规范一致,并能长期维持其有效性,使添加剂对检测结果的影响降到最小。由于血液分析的多样性,故抗凝剂的使用种类较多,抗凝及促凝原理,效果也不一样,常用的有如下几种。
1. 血清管(红帽) :采血管内不含抗凝剂,用于生化、血库和血清学检验。有的内壁涂有硅酮,避免血细胞附壁,防止离心时细胞破碎,释放细胞内物质至细胞外,影响试验结果。有的产品内壁涂有促凝剂,如凝血酶、蛇毒、硅石粉、硅碳素、纤维蛋白酶等,可使血液在10～30 min 凝固。凝血酶可使纤维蛋白原变成纤维蛋白而使血液凝固。纤维蛋白酶是凝血因子ⅩⅢ,亦叫纤维形成酶或纤维蛋白稳定因子,由凝血酶激活,使可溶性纤维蛋白变为不可溶的纤维蛋白多聚体,进而形成稳定的纤维蛋白凝块[2]。
2. 惰性分离胶管(黄帽) :惰性分离胶是一种聚合高分子材料,不溶于水,具有抗氧化,耐高温,抗低温,高稳定性之特性,比重约在1.04～1.05。血清的比重在1.026～1.031 之间,红细胞的比重在1. 092～1. 095 之间。离心时,分离胶液化移到管中央,介于血清或血浆与血液有形成分之间,离心完毕后,固化形成屏障,使血清或血浆与细胞完全分离,保证了血清化学成分的稳定,冷藏下48 h 无明显改变[3]。有的分离胶管含有促凝剂,可大大缩短凝血时间,为更好地形成胶体屏障,采血管应在凝血30 min 后离心。惰性分离胶管内加有肝素,可达到快速分离血浆的目的,样本又可较长时间保存。上述分离胶管可用于快速生化测定。分离胶肝素管适用于急症,急性重症病房(ICU) 等生化检测。与血清管比较最大的优点是血清(血浆) 分离迅速,二是血清(血浆) 化学成分可较长时间稳定不变,便于运输。
3. 肝素抗凝管(绿帽) :肝素是一种含有硫酸基团的粘多糖,分子量15000 ,因有硫酸基团,带有强大的负电荷。其抗凝原理为与抗凝血酶2 Ⅲ(AT2 Ⅲ) 结合,使AT2 Ⅲ的精氨酸反应中心更易与各种丝氨酸蛋白酶起作用,使凝血酶的活性丧失。常用其钠、钾、锂盐,100～125 U/ mg 可使5～10 ml 血液不凝固。肝素是一种极佳的抗凝剂,对血液成分干扰少,不影响红细胞体积,不引起溶血,适用于做红细胞渗透脆性试验、血气、血浆渗透量、红细胞压积、血沉及普通生化测定。因肝素具有抗凝血酶的作用,不适于做血凝试验。过量的肝素会引起白细胞的聚集,不能用于白细胞计数,因其可使血片染色后背景呈淡蓝色,故不适于做白细胞分类。由于肝素不能使离体后的血小板离散,成为单个颗粒或细胞通过微孔,可造成血小板计数减低,白细胞计数及淋巴细胞计数偏高[4]。商品肝素常含有磷酸盐,可使无机磷测定偏高。肝素抗凝血应于短时间内使用,否则搁置过久血液又可凝固。
4. 乙二胺四乙酸(EDTA) 盐管(紫帽) : EDTA 与血液中的钙离子螯合,从而使血液不凝,一般1.0～2.0 mg 可阻止1 ml血液凝固[5]。此抗凝剂不影响白细胞计数及大小,对红细胞形态影响最小,并且可以抑制血小板的聚集,适用于一般血液学检验。抗凝剂浓度过高,渗透压上升,造成细胞皱缩。EDTA 溶液pH 与盐类关系较大,低pH 可使细胞膨胀[6，7]。EDTA2K2 可使红细胞体积轻度胀大,采血后短时间内平均血小板体积(MPV) 非常不稳定,半小时后趋于稳定[5]。EDTA2K2 使钙、镁下降,同时使肌酸激酶(CK)、碱性磷酸酶(ALP) 减低,因这些酶测定需要这些金属离子[8]。EDTA2K3 的最佳浓度是1. 5 mg/ ml ,如果血少,EDTA 浓度增高,中性粒细胞会肿胀分叶消失,血小板会肿胀、崩解,产生正常血小板大小的碎片,使分析结果产生错误[9]。EDTA 依赖的IgM抗体可引起白细胞计数减少,同时造成血涂片时白细胞聚集[10]。EDTA由于螯合钙的作用强,使二磷酸腺苷(ADP) 不能引起血小板聚集,另外EDTA 能抑制或干涉纤维蛋白凝块形成时纤维蛋白单体聚合,不适用于血凝及血小板功能检查,亦不适用于钙、钾、钠及含氮物质测定[11]。白细胞计数在4 ℃可保存48 h ,23 ℃条件下不能超过24 h ,血小板计数4 ℃可保存24 h。国际血液学标准化委员会(ICSH) 推荐使用的抗凝剂是EDTA2K2 ,EDTA2Na2 与EDTA2K2 比较结果无明显变化,但其溶解度低,抗凝速度慢,不适合末梢血的抗凝[5]。EDTA 抗凝的末梢血也宜15 min 后测定,否则血小板有暂时聚集使血小板假性减少,白细胞假性升高,直方图异常[5]。
5. 枸橼酸钠管(蓝帽、黑帽) :抗凝原理为与钙结合,形成可溶性钙螯合物而使血液不凝。NCCLS 推荐的血凝测定要求的抗凝剂浓度是3.2%或3.8% ,相当于0.109 或0.129mol/L ,抗凝剂与血液的比例是1∶9。大部分凝血试验都可用枸橼酸钠抗凝,它有助于Ⅴ因子和Ⅷ因子的稳定[11]。另外,用枸橼酸钠抗凝的血浆做活化部分凝血活酶时间(APTT) 试验,其对肝素的敏感性远远高于草酸盐抗凝血浆,当APTT试验用于监控接受肝素治疗的患者时, 这一点显得非常重要[11]。枸橼酸钠6 mg 才能抗凝1ml血,碱性强,不适于血液化验,亦不适于做生化检测[12],枸橼酸钠对MPV 及其他凝血因子影响极小,可用于血小板功能分析[5]。血小板的聚集作用随血浆中枸橼酸钠的浓度降低而增高,因此在贫血患者应加入较正常人为多的抗凝剂[13]。对于血液凝固试验来讲,如果血液比例过低,APTT 时间会延长,凝血酶原时间(PT) 结果亦会有显著改变[9]。PT 测定,3.8%的抗凝剂比3.2%的国际标准化比值(INR) 值高, 其差别变化一般在0.7～2.7个INR 单位之间[7]。由于枸橼酸钠毒性小,也用于血液保存。
枸橼酸钠在水中溶解慢,故只能配成水剂而不能用粉剂。枸橼酸钠有2 分子水(Na3C6H5O7·2H20) 和5.5 分子水(2Na3C6H5O7·11H2O) 两种,如用后者等渗浓度应为3.8%,但后者很难买到。
抗凝剂浓度高,血沉快,若抗凝剂浓度恰当(无论枸橼酸钠或EDTA) 均不影响血沉的结果,肝素可改变红细胞的Zeta电位,使血沉加快,故不能使用。
6. 草酸盐管:草酸钾是最常用的抗凝剂,优点是溶解度大,与血液混合后可迅速与血中的钙离子结合,形成不溶解的草酸钙,使血液不凝固。常配成10%溶液,0.1ml(10 mg)可使5ml 血液不凝固。常用于血液生化测定,但不适于钾、钙的测定,草酸钾还抑制乳酸脱氢酶(LDH) 、ALP、淀粉酶(AMY) 的活性。由于生成不溶性的草酸钙沉淀,红细胞会出现锯齿状,白细胞出现空泡,淋巴及单核会变形,不易做血片检查。草酸可影响血液中某些成分的活性及与钙形成的不溶性沉淀物可影响自动凝血仪测定时光电终点的观察,所以草酸钾很少用于血液学分析及血凝测定[11]。
7. 草酸钾2氟化钠(灰帽) :氟化钠是一种弱抗凝剂,浓度达6～10 mg/ml 血液才有抗凝作用,但它是血糖测定的优良保存剂,2 mg/ml 血液即能抑制糖分解。一般常同草酸钾合并使用,其比例为氟化钠1 份,草酸钾3 份,此混合物4 mg 可使1 ml 血液在2～3d 内不凝固和抑制糖分解[12]。氟化钠不能用于尿素酶法测定尿素,也不能用于ALP 和AMY测定,因氟化物可激活尿素酶、淀粉酶[14]。氟化钠用量大时可造成溶血。
三、真空采血管使用中应注意的几个问题
1. 取血时患者应松弛,环境温暖,防止静脉挛缩。束膊时间不可过长,禁止拍打手臂,否则可造成局部血液浓缩或激活凝血系统。握拳2 min 后可使钾的血清浓度增加1.0～1. 5 mmol/ L[8]。血液采集应一针见血, 以防止组织损伤,外源性凝血因子进入试管,影响试验结果[9]。
2. 样本采集血量要充足,真空的存在易使血球破裂,若使用不足血样,采血后应开启瓶塞片刻。
3. 使用含促凝剂或分离胶的采血管时,一定要等血液凝固后再离心,否则血清中易出现凝块而造成仪器堵孔。血清管(红)一般要等0.5～1h ,含促凝剂的要等10～30 min ,肝素管(绿) 混匀后充分抗凝后即可离心分离血浆,分离胶管(黄)5～10 min 后离心。
4. 推荐的采血顺序为凝血管(血清管) →枸橼酸钠管→肝素或EDTA 管→草酸钾2氟化钠管→血沉管。主要原因是第一管内往往含有组织液,易造成凝血,不适于做血凝测定。
5. 采血完毕后,先将最后一支试管抽离持针器,然后将针头由静脉拔出,如有漏血,除针头安装不严外,多见于止血保护套剥下或止血护套回弹过慢或不能回弹到位所致。
6. 含添加剂管的头部应预留足够的空间,一般为15%～20% ,使血液得到充分的混匀。
7. 血液与抗凝剂的比例必须精确,抗凝剂在血标本中的绝对含量可改变血浆中钙离子浓度进而影响实验结果。钙的绝对浓度越高,PT、APTT凝固时间越短。
8. 采血过程中不能产生空泡,否则易导致(Fg) 和Ⅴ、Ⅷ因子变性。采血后瓶盖不可取下,否则由于二氧化碳(CO2)的散失而使血液pH 升高,而pH 的升高具有激活凝血系统的作用。
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