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显微镜知识(五) (2008/07/17 11:09)

荧光镜检术

   荧光镜检术是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体,使之受激发后而产生长波长的荧光,然后观察。荧光镜检术广泛应用于生物,医学等领域。

 1.荧光镜检术一般分为透射和落射式两种类型。

1)透射式:激发光来自被检物体的下方,聚光镜为暗视野聚光镜,使激发光不进入物镜,而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮,而高倍则暗,在油浸物镜下较难操作,尤以低倍的照明范围难于确定,但能得到很暗的视野背景。透射式不适用于非透明的被检物体。

2)落射式:透射式目前几乎被淘汰,新型的荧光显微镜多为落射式,光源来自被检物体的上方,在光路中具有分光镜,所以对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用,不仅便于操作,而且从低倍到高倍,可以实现整个视场的均匀照明。

 2.荧光镜检术的注意事项

1 激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现像,因此尽可能缩短观察时间,暂时不观察时,应用挡板遮盖激发光。

2)作油镜观察时,应用无荧光油

3)荧光几乎都较弱,应在较暗的室内进行。

4)电源最好装稳压器,否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命,也会影响镜检的效果。

 目前许多新兴生物研究领域应用到荧光显微镜,如基因原位杂交(FISH)等等。


第二节 偏光显微镜Polarizing microscope

一.偏光显微镜的特点

 偏光显微镜是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射的物质,在偏光显微镜下就能分辨清楚,当然这些物质也可用染色发来进行观察,但有些则不可能,而必须利用偏光显微镜

 偏光显微镜的特点,就是将普通光改变为偏光进行镜检的方法,以鉴别某一物质是单折射(各向同行)或双折射性(各向异性)。

 双折射性是晶体的基本特性。因此,偏光显微镜被广泛地应用在矿物,化学等领域。在生物学和植物学也有应用。

二.偏光显微镜的基本原理

 偏光显微镜的原理比较复杂,在此不作过多介绍,偏光显微镜必须具备以下附件(a)起偏镜 b)检偏镜 c)专用无应力物镜 d)旋转载物台。

三. 偏光镜检术的方式

(一) 正相镜检(Orthscope):又称无畸变镜检,其特点是使用低倍物镜,不用伯特兰透镜(Bertrand Lens,同时为使照明孔径变小,推开聚光镜的上透镜。正相镜检用于检查物体的双折射性。

(二) 锥光镜检(Conoscope):又称干涉镜检,这种方法用于观察物体的单轴或双轴性。

四. 偏光显微镜在装置上的要求
 (一) 光源:最好采用单色光,因为光的速度,折射率,和干涉现像因波长的不同而有差异。一般镜检可使用普通光。

 (二) 目镜:要带有十字线的目镜。

 (三) 聚光镜:为了取得平行偏光,应使用能推出上透镜的摇出式聚光镜。

 (四) 伯特兰透镜:这是把物体所有造成的初级相放大为次级相的辅助透镜。

五. 偏光镜检术的要求

(一) 载物台的中心与光轴同轴

(二) 起偏镜和检偏镜应处于正交位置。

 (三) 制片不宜过薄。

第三节 倒置显微镜Inverted microscope

 前面讲的是正立式显微镜的镜检方式,主要用于切片的观察。而倒置显微镜是为了适应生物学、医学等领域中的组织培养、细胞离体培养、浮游生物、环境保护、食品检验等显微观察。

 由于上述样品特点的限制,被检物体均放置在培养皿(或培养瓶)中,这样就要求倒置显微镜的物镜和聚光镜的工作距离很长,能直接对培养皿中的被检物体进行显微观察和研究。因此,物镜、聚光镜和光源的位置都颠倒过来,故称为倒置显微镜

 由于工作距离的限制,倒置显微镜物镜的最大放大率为60X。一般研究用倒置显微镜都配置有4X10X20X、及40X 相差物镜,因为倒置显微镜多用于无色透明的活体观察。如果用户有特殊需要,也可以选配其它附件,用来完成微分干涉、荧光及简易偏光等观察。目前倒置显微镜广泛应用于patch-clamp ,transgene ICSI 等领域。

第四节 体视显微镜Stereo microscope

 体视显微镜又称实体显微镜解剖镜,是一种具有正像立体感地目视仪器,被广泛地应用于生物学、医学、农林、工业及海洋生物各部门。它具有如下地特点:

 1 双目镜筒中的左右两光束不是平行,而是具有一定的夹角——体视角(一般为12---15度),因此成像具有三维立体感;

 2 像是直立的,便于操作和解剖,这是由于在目镜下方的棱镜把像倒转过来的缘故;

 3 虽然放大率不如常规显微镜,但其工作距离很长

 4 焦深大,便于观察被检物体的全层。

 5 视场直径大。

 目前体视镜的光学结构是:由一个共用的初级物镜,对物体成像后的两光束被两组中间物镜——变焦镜分开,并成一体视角再经各自的目镜成像,它的倍率变化是由改变中间镜组之间的距离而获得的,因此又称为连续变倍体视显微镜Zoom—stereo microscope)。

 随着应用的要求,目前体视镜可选配丰富的选购附件,如荧光,照相,摄像,冷光源等等。 

前面所说各种像差除场曲外,都影响像的清晰度。畸变是另一种性质的像差,光束的同心性不受到破坏。因此,不影响像的清晰度,但使像与原物体比,在形状上造成失真。



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