多糖的GC分析 (2008/09/14 07:52)

多糖的GC分析

气相色谱是多糖结构分析中最重要的手段之一，它与质谱联用可以得出有关单糖残基类型、键的连接方式、糖的序列和糖环形式、聚合度等多种结构信息。此外，由于大量的固定液和不同的检测器适用于糖的气相色谱分析，因而用气相色谱法测定糖类具有选择性好、样品用量少、分辨率强、灵敏度高、分析速度快以及可用于定性及定量分析等优点。气相色谱要求试样具有良好的挥发性和热稳定性。多糖本身为大分子物质，且由于含大量羟基不能在高温下直接挥发而不适用于气相色谱，因而将大分子多糖降解为结构单糖或寡糖，并且将其衍生成具有易挥发，对热稳定的衍生物的各种方法也应运而生。通过对这些降解糖衍生物的定性和定量测定，即可得出多糖的基本结构。作为多糖结构研究的一个重要环节，分析多糖的单糖组成时，一般将多糖水解还原后制成糖醇乙酰酯或糖腈乙酰酯衍生物，然后进行气相色谱分析，这样可消除单糖的异构峰。

1：多糖的降解

1 酸水解

酸水解是气相色谱技术用来确定多糖中各种单糖组分的前提。应根据不同键的水解难易和不同单糖的稳定性确定糖的最佳水解条件。常用于水解多糖的酸类有：盐酸、硫酸和三氟醋酸。硫酸主要用于水解中性糖；三氟醋酸可用于植物细胞壁多糖、糖蛋白及糖胺聚糖的水解，而盐酸则用于糖蛋白和含氨基脱氧糖的多糖水解。Ruiter等比较了这些酸水解方法的优缺点，根据他们的实验结果，认为甲醇解结合三氟醋酸解可得到最佳的水解效果，其次，醋酸、甲酸也常用于特定多糖柏部分水解。如甲基化多糖和多糖的高碘酸氧化产物的部分水解，所得的短链寡糖经衍生化后可用气相色谱分离和鉴定。

2 甲醇解和醋酸解

这是多糖的水解与甲酰化或乙酰化同时进行的一种水解方式。由于水解释放的还原末端迅即得到新形式的甲基或乙基糖苷的保护，从而使得中性单糖的回收率大大提高。同时，这些水解方式对脱氧糖的破坏程度比硫酸小得多。甲醇解和醋酸解还可以使糖醛酸的羧基及神经氨酸(neuraminie acid)的产物转变为相应的甲酯或醋酸酯，因而大大地提高了它们的挥发性。这洋，就使得利用气相色谱同时分离鉴定含中性、酸性和碱性糖的多糖和糖蛋白成为可能，常用的甲醇解试剂为无水盐酸一甲醇，而醋酸解试剂则为冰醋酸一醋酸酐(1：1，V /V)及硫酸的混合物。Roberts等还将甲醇解方法进一步简化，并用硫酸代替氯化氢，甲醇解产物的产率也大为提高。

3 碱降解

它是断裂N-糖昔键的有效方法。此法可以提供一些酸水解不能获得的结构信。为了防止所得的寡糖被进一步水解，碱降解需要在还原剂如硼氢化钠的存在下进行。

2：甲基化分析

甲基化是多糖结构测定中最重要的手段。气相色谱所能提供的多糖的大部分结构信息都是从对多糖的甲基化水解产物的分离、鉴定来完成的。常用的甲基化试剂有：硫酸二甲酯与氢氧化钠(Haworth法)．氧化银与碘甲烷(Purdie法)等。目前最广泛采用的是Hakomorl法 。即用二甲亚砜和氢氧化钠制备甲基亚磺酰负碳离子，用碘甲烷作甲基化试剂，经气相色谱和质谱分离鉴定，从甲基化产物判断糖苷键的位置与分支，从非还原末端多少判断多糖分子的长度。Alhersheim 等人还利用乙基化分析作为对甲基化分析结果的补充．对某些在气相色谱中不能分离的部分甲基化糖醇醋酸酯的多糖组分，经乙基化分析会有良好的分离效果。反之亦然。乙基化反应与Hakomori甲基化方法相同．但是，在反应的最后阶段要用碘乙烷代替碘甲烷。

3：Smith降解

多糖中的连二连三羟基被高碘酸氧化后生成非环状半缩醛，它比糖苷键易水解。在酸水解之前，先用硼氢化钠把它们还原成多聚糖醇，然后用稀酸水解，水解产物经三甲基硅烷化或乙酰化后由气相色谱鉴定其产物(甘油、甘油醛、赤藓糖、游离单糖分子)可用于判断糖苷键型。

适用于气相色谱分析的糖的衍生法

1 三甲基硅烷化

Sweeley等提出的三甲基硅烷化方法是糖的羟基衍生化的主要方式之一。优点是：衍生物挥发性强，制备快速、简便。衍生化反应可在室温下几分钟完成，它可适用于醛糖、酮糖、甙、糖醇、糖醛酸和脱氧糖等的衍生化。缺点是：由于各种单糖异构体和不同大小环的特殊单糖的存在，造成色谱峰多于组分单糖的数目，从而导致混合物的定性定量分析复杂化。硅烷化的常用溶剂为无水吡啶，硅烷化试剂为六甲基二硅胺烷(HMDS)和三甲基氧硅烷(TMCS)。

2 糖的三氟醋酸酯衍生物和糖醇醋酸酯衍生物

这两种方法的特点是在衍生化之前先用硼氢化钠还原，除去硼酸盐后，用三氟醋酸酐的毗啶或四氢呋喃溶液处理糖醇，可得糖的三氟醋酸酯衍生物，用无水吡啶和醋酸酐可将糖醇转变为相应的糖醇醋酸酯衍生物。由于除硼酸盐过程非常耗时且麻烦，McGinnis等用1一甲基咪唑作为衍生化溶剂，硼酸盐可不必除去，整个乙酰化过程可在不到lO分钟内完成，从而大大地加快和简化了衍生化过程。糖的三氟醋酸酯衍生物挥发性强，可用强极性柱分离，分辨率显著提高，并可采用高灵敏度的电子捕获检测器检测，因而试样量可显著减少。糖醇醋酸酯衍生物的优点是每个糖仅有一个峰，衍生物十分稳定，缺点是操作麻烦且耗时。

3 糖肟和糖腈衍生物

如上所述，将醛糖用硼氢化钠还原成糖醇可有效地克服由于糖的异构化而造成的多峰现象。但异头碳原子的还原，会使某些己糖或戊糖被还原成相同的糖醇。如D一阿拉伯糖和D-来苏糖都将产生阿拉伯糖醇，D-葡萄糖和L-古罗糖都可被还原成山梨糖醇 。为了解决这个问题，可在衍生化之前将糖和盐酸羟胺在吡啶溶液中加热反应生成糖肟。由于顺式和反式椅象的存在，硅烷化的糖肟在气相色谱分离后仍将出现两个峰，但其复杂程度远低于直接硅烷化的结果。另外，在反应生成的糖肟吡啶溶渡中加入醋酸酐，加热继续反应可使其生成具有挥发性的糖氰醋酸酯衍生物。

4 手性糖苷的衍生化

由一种糖的D-型和L一型对映体形成的糖苷是非对映的，但可通过适当的衍生化用气相色谱加以分离。试样经盐酸一丁醇解后，用碳酸银中和，滤液彻底干燥，经三甲基硅烷化后用气相色谱分离。试样也可用含三氟乙酸的(+)2-辛醇预处理后再乙酰化。用这种方法衍生的手性糖苷在空心柱上有很好的分离教果。

5 氨基糖的衍生化

氨基糖中的氨基通常是以N-乙酰基的形式存在的。Hurst发现氨基糖的直接硅烷化是不完全的。Mononen等用硝酸使氨基糖脱氨后还原成2、5一脱水己糖醇，再进行硅烷化或三氟乙酰化可有效地解决这个问题。Neeser提出先用4mol/L三氟醋酸将试样水解，然后将产物转变为O-甲基肟醋酸盐，这种方法可使中性糖和氨基糖同时衍生化，在气相色谱中可得到有效的分离。

6 糖醛酸的衍生化

羧酸经直接硅烷化衍生成的酯键对水解特别敏感。Lehrfeld提出的一种方法特别适用于糖醛酸糖基的衍生化。即醛糖和糖醛酸的混合物先用硼氢化钠还原，当糖醛酸内酯化后，用正丙胺将其转化为相应的N-(1-丙基)一醛胺，然后用醋酐和吡啶将其乙酰化后进行气相色谱分析。

衍生化糖的气相色谱测定

气相色谱分离鉴定衍生化糖使用最多的是氢火焰离子化检测器(FID)。如果在衍生化过程中导入一些强的负电荷原子(如三氟乙酰化)，可选用更为敏感的选择性电子捕获检测器(ECD)，它可检测10‾¹²g级含量的糖．某些含氮糖类，如氨基脱氧糖和神经氨酸(neu—ramie acid)衍生物，也可在其它糖存在的情况下用热离子氮磷检测器(NPSD)检测，它的灵敏度比氢火焰离子化检测器大约高5倍。另外，NPSD也适用于含磷糖类的检测酰基衍生物，特别是三氟醋酸酯衍生物，比相应糖苷的醋酸酯衍生物的保留时间短，因而可采用一些较强极性的固定液来分离。但应该注意各固定液的温度上限，以防固定液的流失。氰烷硅酮类，如OV-225．OV-275，Silar，SP 2340等有较高的高温上限，因此适于分离二糖和糖醇试洋。OV-210不太适于三氟醋酸酯衍生物的分离，因为这类衍生物会一定程度地破坏OV一910D，Sullivan和Sehewe等采用OV一17柱可有效地分离寡糖的三氟醋酸酯衍生物，用适当浓度的Dexsil可有效地分离高聚寡糖的三氟醋酸酯衍生物。硅烷化衍生物常用一些中等极性的固定液(如XE一60，XF一1150，QF—l等)。因为低极性的固定液难以得到好的分离效果，而强极性固定液又会导致峰的拖尾现象发生。一些弱极性的固定液，如SE-54或OV-1不适于分离一些保留时间较短的中性糖衍生化的对映体(L和D型)的气相色谱分离可在手性的聚硅氧烷固定液中进行。手性相的XE-60-L-缬氨酸(s)-α-苯乙胺适用于三氟乙酰化的甲基己醛糖的分离。另外还有一些手性聚硅氧烷固定涟则适用于戊醛糖和糖醇衍生物的分离，这些方法可定量测定D型和L型糖的比例，但其不足之处在于衍生物的挥发性低，为洗脱衔生物而需的高柱温又会导致试样的分离状况很差。Konig等用全戊基α-环化糊精作为空心柱气相色谱的手性固定相，它与三氟乙酰化的甲基糖苷、1，4和1，5-脱水糖醇、聚醇和多羟酸甲酯有很强的识别对映异构体的分子相互作用能力，有效地分离各种己糖和戊糖的D型和L型 目前，环化糊精衍生物固定相的研究已成为分离糖的手性化合物的热门研究课题。对于一些复杂多糖而言，由于其甲基化的水解产物含有多个峰。且某些峰的保留时间非常接近，为了有效地分离这些物质，人们已采用空心柱来代替填充柱。由于空心柱具有柱容量小、柱效高、柱渗透率强等优点，因此其分离效果很好，试样需要量少，分析速度快。即使采用非极性和非选择性固定液的空心管柱也可得到满意的分离效果，而同样的分离，用填充柱则需选择性的固定相。目前，对于复杂多糖已逐渐地采用毛细管柱代替填充柱。人们普遍采用的涂壁空心柱(WCOT)和涂载体空心柱(SCOT)用于衍生化糖的分离鉴定。一些商品空心柱(SP一2100，SE-30，OV一101，OV一1等)已不同程度地用于糖的分离和结构测定中。曾昭睿等采用三-端烯丙基-不对称二苯并-14-冠-4-二羟基冠醚做固定相分离了鼠李糖，岩藻糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖的乙酸酯衍生物。